莽草*生物合成途径的调控

写范文发表于:2019-01-08 02:03:39

生物技术通报

·综述与专论·

莽草*生物合成途径的调控

biotechnologybulletin

2009年第3期

莽草*生物合成途径的调控

汪华

崔志峰

(浙*业大学生物与环境工程学院,杭州310032)

要:莽草*是合成生物碱等许多其它物质的前体。近年来,莽草*作为临床上惟一有效的抗禽流感*物———

达啡的原料而倍受关注。简述了莽草*生物合成的途径,着重从基因工程角度分析了莽草*合成过程中的关键酶及其对莽草*产量的影响,旨在为研究和开发微生物工程菌生产莽草*提供参考。

关键词:莽草*

生物合成途径

遗传改造

工程菌

regulationofshikimicacidbiosynthesispathway

wanghuacuizhifeng

(collegeofbiologicalandenvironmentalengineering,zhejianguniversityoftechnology,hangzhou310032)abstract:shikimicacidasprecursorforbiosynthesisofalkaloidandotherpounds,hasbeenconcernedrecentlyasthekeymaterialforthesynthesisoftamiflusthatistheonlyoneeffectiveclinicdrugagainstavianinfluenza.inthisfunctionsofkeyenzymesinthebiosynthesispathwayofshikimicacidwereanalyzed,andthebreedingofpaper,

engineeringbacteriumbygeicimprovementsforhighyieldofshikimicacidwasalsodiscussed.

keywords:shikimicacidbiosynthesispathwaygeicimprovement

geicallyengineering

bacterium

莽草*(shikimicacid,sa),化学名为3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧*,其结构式,如图1。它是合成许多生物碱、芳香氨基*、吲哚衍生物与手**物(如抗病毒*)的前体,其自身具有抗炎、镇痛作用,并可能通过影响花生四烯*代谢,抑制血小板聚集以及凝血系统而发挥抗血栓形成的作用[1]。此外,莽草*是合成目前在临床上惟一一种有效抗禽流感*物-**奥斯米韦(商品名为哒啡)的合成原料[2]。

*含量为10%以上。由于八角茴香属于木兰科东方小型树种结出的果实,分布在全球极少数地区,产量受气候等自然环境影响较大,严重限制了莽草*的产量。化学合成莽草*有多种途径,但产率不高,如diels-alder和逆diels-alder反应合成法的产率都只有15%左右,且工艺复杂。生物合成法是利用经过改造的微生物大规模发酵生产莽草*的方法,即以经过基因修饰得到的大肠杆菌为生产菌株,以葡萄糖为原料大规模发酵合成莽草*。大肠杆菌体内莽草*合成途径的关键酶与莽草*产量的高低关系密切,因此,对莽草*合成过程中的关键酶及其调控进行深入研究,有助于提高莽草*的产量。

图1莽草*结构式

1莽草*生物合成途径

莽草*途径是芳香族氨基*合成过程中的一

获得莽草*的方法有多种,主要包括生物提取、化学合成和生物合成。与动物细胞不同,植物和微生物细胞普遍能合成莽草*。木兰科植物八角茴香的果实是工业上获得莽草*的主要来源,其莽草

段共同代谢途径(图2)。葡萄糖经糖酵解和**戊糖途径分别生成**烯醇式***(pep)和赤藓糖-4-**(e4p),两者在3-脱氧-阿拉伯庚*糖*-

7-**(dahp)合成酶的催化下进入莽草*途径,

收稿日期:2008-09-01

作者简介:汪华(1984-),男,硕士研究生,研究方向:生物化工;e-mail:fanye000@126通讯作者:崔志峰(1956-),男,博士,副教授;tel:0571-88320741,e-mail:*[email protected]

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*化反应,使莽草*累积。野生型菌株有两个莽草*激酶同工酶,包括激酶Ⅰ和激酶Ⅱ,分别由基因

arok和arol编码,激酶Ⅱ是转化过程中的主要催

化酶,而激酶Ⅰ的酶活力有限。敲除arol基因,保留arok基因,使微生物细胞保留微弱的莽草*激酶活*以便累积莽草*的同时还能自身合成芳香族氨基*和维生素等物质而无需额外添加[4]。此外,利用p1噬菌体作介质,使tn10和cmr基因分别*arol的478位碱基对和arok的17位碱基对,通过完全缺失莽草*激酶活力以切断下游生化反应,使得合成的莽草*无消耗而大量累积[5]。

解除3-脱氧-阿拉伯庚*糖*-7-**(dahp)合成酶的反馈抑制是增加莽草*产量的另一关键因素。dahp的3个同工酶分别由arof、arog、aroh

①3-脱氧-阿拉伯庚*糖*-7-**合成酶(3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphatesynthase);②脱*奎尼*合成酶(3-de-hydroquinicacidsynthase);③脱*奎尼*脱水酶(3-dehydroquinicaciddehydratase);④莽草*脱*酶(shikimatedehydrogenase);⑤莽草*激酶(shikimatekinase);⑥5-烯醇**酰莽草*-3-**合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase);⑦脱*圭尼*脱*酶(dehydroquinatedehydrogenase);⑧脱*莽草*脱水酶(de-hdroshikimatedehydratase)

编码,其酶活力的比值大约为25∶75∶

148号氨基*残基由原来的pro转变为leu时,此

突变株对酪氨*反馈抑制不敏感[6]。将该突变基因导入菌株中,能够解除dahp合成酶受酪氨*反馈抑制,引导更多的底物进入莽草*合成途径。

图2莽草*生物合成途径

经过一系列酶促反应合成莽草*,最终生成酪氨*、*氨*、苯*氨*3种芳香族氨基*。该途径中有3个酶对莽草*产量有重要影响:(1)3-脱氧-阿拉伯庚*糖*-7-**合成酶,大肠杆菌中存在3种该酶的同工酶,且分别受终端产物3种氨基*的反馈抑制,限制了底物流入该途径合成莽草*;(2)脱*圭尼*合成酶,该酶催化3-脱氧-阿拉伯庚*糖*-7-**转化,当大量3-脱氧-阿拉伯庚*糖*-

draths等[5]将对酪氨*反馈抑制不敏感的dahp

合成酶基因(aroffbr)导入莽草*激酶活*完全缺失的大肠杆菌细胞内,同时为了提高脱*圭尼*合成酶(基因arob编码)活力及补偿莽草*脱*酶(基因aroe编码)活力,增加了arob和aroe基因拷贝数,构建了莽草*生产菌株。结果表明,以葡萄糖为原料,补料分批发酵培养42h,获得莽草*27.2g/

7-**合成后,该酶不能及时将上游产物转化为3-脱*圭尼*而使其发生去**化,降低了莽草*的产量;(3)莽草*脱*酶,该酶将3-脱*莽草*还原为莽草*,同时受到莽草*的反馈抑制。

l;圭尼*12.6g/l;脱*莽草*4.4g/l,莽草*有

明显的累积。

3莽草*合成过程中底物利用率的提高

上述工程菌的应用使莽草*合成途径得到了

2莽草*合成途径的分子生物学改造

在野生型菌株中,莽草*是芳香族氨基*合成

改良,由于底物赤藓糖-4-**和**烯醇式***能够有效的转变为产物,莽草*产量得到了大幅提升。因此,进一步提高底物的流入量有可能促进莽草*产量达到进一步提高。

途径的中间代谢物,不会在细胞内累积,为了获得大量的莽草*,必须切断或限制下游生化反应。

marco等[3]敲除5-烯醇**酰莽草*-3-**合成酶

基因,使莽草*-3-**大量累积,后者去**化后就获得目标产物。敲除莽草*激酶能阻断莽草**

3.1过量表达tkta基因增加赤藓糖-4-**的合成基因tkta编码的转*酶对赤藓糖-4-**合成

量有重要影响。李永辉等[7]从大肠杆菌k-12株中

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扩增了基因tkta,该基因在工程菌中的高效表达使转铜酶的活*提高了3.9倍,dahp的合成量提高明显。david等[8]通过增加tkta的拷贝数提高了转*酶的活力,使得赤藓糖-4-**合成量增加,最终进入莽草*代谢途径的碳量增加为原来的两倍,莽草*合成途径的总产率由20%上升到29%,副产物圭尼*和3-脱*莽草*的产量分别由8.1g/l提高到19g/l和6.5g/l提高到11g/l,但莽草*的产量仅由26g/l上升为28g/l。可以看出,tkta基因的过量表达增加了底物合成量,但副产物的过多合成消耗了底物,使得莽草*的合成量没有明显提升。

60g/l,途径产物的总产率为41%(mol/mol);而pts转运系统下,相应的产量和产率分别为49g/l

和33%(mol/mol)。以半乳糖转运蛋白作为葡萄糖转运载体时,在发酵培养60h后,3-脱*莽草*产量为60g/l,途径产物总产率为43%(mol/mol)。可以看出,利用非**烯醇式***供能的葡萄糖转运系统,节约了大量的pep用于莽草*合成,目标产物和途径总产率都有明显提高,副产物合成较少,是比较理想的增产方式[10]。

4降低副产物形成的措施

经过对莽草*合成途径的一系列调控后,莽草

*的产量有了明显的提升,但同时圭尼*等副产物

3.2提高**烯醇式***的利用率

**烯醇式***(pep)是一种高能化合物,

的合成量也随之增加。副产物在发酵液中的累积对后续莽草*的分离提纯有较大影响,如圭尼*会影响莽草*的结晶纯化。关于副产物的形成机制有不同的观点,其一认为:当莽草*积累到一定浓度时,分泌到细胞外的莽草*重新转运入胞质内,逆莽草*合成方向生成圭尼*[5,8]。当培养基中的葡萄糖浓度过低时,莽草*转运系统的效率降低,莽草*不能及时转运到胞外,使其在胞内累积,促使反应平衡逆方向进行,生成各种副产物[4]。目前,基于第一种观点的降低副产物措施研究得较多。

在葡萄糖转运(pts系统)过程中提供能量而转变成***被消耗。基因ppsa是pep合成的关键酶基因,利用iptg诱导表达调控系统,调控表达基因

ppsa,可以提高pep的合成量。通过破坏aroe基

因,切断了3-脱*莽草*转化为莽草*的反应,使

3-脱*莽草*累积,其产量可以作为考察指标。在

增加基因tkta拷贝数的同时,当iptg的浓度为12

mg/l、pep合成酶活力增加为原来的7倍时,3-脱

*莽草*产量上升到69g/l,途径总产率为51%(mol/mol),比未增加拷贝前产量增加17g/l,但副产物3-脱氧-阿拉伯庚*糖*,3-脱*圭尼*,没食子*等也有合成;当iptg浓度为48mg/l、pep合成酶活力增加为原来的15倍时,3-脱*莽草*产量为58g/l,产率为29%(moldhs/molglucose)。出现这种现象的原因可能是pep合成酶的表达量到达了细胞生化反应产能能力的临界状态所以降低了***的可利用率[9]。

4.1利用代谢物抑制效应抑制圭尼*合成当培养基中葡萄糖被消耗殆尽时,莽草*被视

为碳源而被转运回胞内利用。借助代谢物抑制效应,提高培养基中葡萄糖的浓度可以抑制莽草*的重新被利用。当提高培养基中葡萄糖浓度、发酵培养42h后,圭尼*合成量由原先的12.6g/l下降到1.9g/l,莽草*与圭尼*的摩尔比由原来的2.4∶1提高到11.8∶1[5]。但是,高浓度葡萄糖培养条件下容易产生副产物乙*,使得微生物的生长受影响,从而降低产量。葡萄糖类似物甲基-α-d-葡萄糖苷在培养基中稳定,可以被转运至胞内且**化,却不参与其他代谢,因此可以用于抑制副产物的合成[8]。

pts系统每转运一分子葡萄糖要消耗一分子

**烯醇式***,采用葡萄糖协助蛋白和葡萄糖激酶组成的转运系统,以及半乳糖转运蛋白等非**烯醇式***供能的葡萄糖转运系统代替pts转运系统,能够节约**烯醇式***用于莽草*合成[10]。在增加基因tkta拷贝数同时,运动发酵单胞菌(zymomonasmobills)葡萄糖协助蛋白基因glf和葡萄糖激酶基因glk被导入pts系统缺失的大肠杆菌。发酵培养48h后,3-脱*莽草*产量达到

4.2利用shia基因的缺失阻止莽草*进入胞内基因shia编码的蛋白是莽草*转运蛋白。

knop等[8]构建了基因shia缺失菌株e.colisp1.1s-hia/pkd12.138,该工程菌导入了基因aroffbr,增加

了基因arob、aroe、tkta拷贝数、缺失了arol、arok基因。发酵培养48h后,合成莽草*23g/l,圭尼

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*22g/l,3-脱*莽草*9.6g/l;未缺失基因shia前,莽草*的合成量为28g/l,圭尼*19g/l,3-脱*莽草*11g/l。可见,缺失基因shia对降低圭尼*的合成效果不明显。为了研究缺失基因shia后莽草*是否发生逆向转运,构建了dahp合成酶活力及基因shia缺失的菌株e.colisp1.1shia/psc-

最近,ran等[13]利用2-*-3脱氧-6-**半乳糖*(kdpgal)醛缩酶催化***和赤藓糖-4-**合成3-脱氧-阿拉伯庚*糖*-7-**。通过易错

pcr、基因“洗牌”、多位点定向进化等技术对大肠

杆菌中编码该酶的基因进行改造,最终使得该酶活大幅度提升。在缺失3种dahp合成酶酶活的菌株中,只依靠改造后的醛缩酶的催化活力,使得3-脱*莽草*的产量从2g/l提高到13g/l[14]。这一合成3-脱氧-阿拉伯庚*糖*-7-**的辅助途径也值得进一步研究。

莽草*以其自身重要的*用价值以及作为合成其他*物的良好前体物质,具有广阔的市场前景,并由此带来可观的经济收益。目前,抗禽流感*物达啡产量不足主要原因之一是合成原料-莽草*产量不足。以葡萄糖为原料,利用大肠杆菌工程菌生产莽草*具有周期短、成本低、污染少、对环境友好、受地域环境影响小及产量稳定等优点,必将成为莽草*生产的主流。通过对大肠杆菌工程菌莽草*合成过程中关键酶的基因本质及其调控的深入研究,有望进一步提高莽草*的产量。

参考文献

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5.214a。接种12h后,向培养基中添加莽草*,40h

培养后检测到圭尼*,但合成速率下降明显[8]。说明缺失shia基因后,莽草*仍然被转运入细胞内,由此推测除了基因shia编码的莽草*转运蛋白外,可能存在其他莽草*转运机制。

4.3arod.e酶替代arod酶和aroe酶,抑制3-脱*莽草*产生

副产物圭尼*合成被抑制后,3-脱*莽草*成

为莽草*的反馈抑制的主要副产物,在*植株中,3-脱*圭尼*脱水酶和莽草*脱*酶的活**到一种酶中,该酶由arod.e基因编码,催化3-脱*圭尼*直接转化为莽草*,避免了中间物3-脱*莽草*。将该基因转入了arod和aroe缺陷的大肠杆菌中,但是3-脱*莽草*的合成没有被抑制,圭尼*的合成却被抑制[8]。最近,有学者对拟南芥中同样的双功能酶进行了研究,这将为莽草*途径的改造提供新材料[12]。

5展望

通过改造莽草*合成途径或增加底物的流入

量,莽草*的产量有了大幅提高,但是副产物产量也随之增加。研究表明,副产物的形成与莽草*的转运机制有密切联系,且转运机制复杂,但还有待进一步的深入研究。莽草*脱*酶在副产物形成中有重要作用。第一,受莽草*的反馈抑制使3-脱*莽草*滞留;第二,由于3-脱*圭尼*与莽草*结构相似,莽草*脱*酶能将其还原为圭尼*。现已发现大肠杆菌中莽草*脱*酶有两类,包括

[5]

aroe和ydib。ydib是一种双供能酶,能够催化3-脱*圭尼*转化为圭尼*,形成副产物;ydib的序列及关键氨基*[15]都已阐明,并进行了定点突变的研究[16]。这些研究对降低副产物合成,提升产量将有重要意义。

 

第2篇:植物淀粉合成的调控酶

植物淀粉的生物合成主要涉及了4种酶-ADPG焦**化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶,它们在淀粉的生物合成中发挥着不同作用.近年来,随着基因工程技术的迅速发展及与这些酶有关的众多突变体的发现,使人们对这些酶的结构、特*、功能及表达调控等方面的研究取得了重要进展.并且,人们已开始利用基因工程技术调控植物淀粉的数量与特*,取得了一定成效.在此,文章介绍了调控植物淀粉合成关键酶的生化特*、基因调控及利用基因工程改良植物淀粉等方面所取得进展.

 

第3篇:植物内源茉莉*类物质的生物合成途径及其生物学意义

茉莉*类物质(JAs)是新确认的一类广泛存在于植物体内的内源激素,在植物的生长发育、应激反应和次生代谢过程中起着重要的调控作用.该文主要概述了植物中茉莉*类物质的生物合成途径、各关键酶的生理作用及其在植物次生代谢工程等方面的研究进展,并探讨了茉莉*类物质的潜在应用价值.

皮妍,侯嵘(复旦大学生命科学学院,上海,200433)

唐克轩(复旦大学生命科学学院,上海200433;上海交通大学农业与生物学院,上海200240)